1606年,史密斯夫妇受弗吉尼亚公司的雇佣,在弗吉尼亚殖民地定居以获取利润。1606年12月,他们分乘三艘船起航。史密斯有一个叫塞缪尔-科利尔的仆人。塞缪尔-科利尔在大部分时间里都会待在他身边。
航行中出现了一些问题,史密斯被指控犯有叛变罪。纽波特船长计划将他处死。船长打开了一封来自弗吉尼亚公司的命令信,信中说,史密斯将成为新殖民地的领导人之一,因此史密斯没有被杀。
英国人于1607年4月抵达,温菲尔德船长选择詹姆斯敦作为殖民地的所在地。夏天,定居者们仍然住在临时住房里。经过四个月的海上旅行,食物供应只够每人每天吃一两杯谷物粉。由于天气和食物的缺乏,疾病在人们中间蔓延,到9月,一半以上的人死亡。
1607年12月,史密斯在寻找食物时被美洲原住民抓住。他被带去见波瓦坦部落的酋长。该村离詹姆斯敦约15英里。史密斯没有受到伤害就被释放了,这部分归功于酋长的女儿波卡洪塔斯,她把自己横在他的身上。看到这一幕,她的父亲对史密斯大发慈悲,他被安全地带回了詹姆斯敦。这次相遇开始了当地人、史密斯和詹姆斯敦的殖民者之间的友好关系。1608年1月初,近100名新定居者随纽波特船长抵达,由于大意,村子被人放火烧了。那年冬天,詹姆斯河结冰了,定居者们被迫在废墟中生活。在这期间,纽波特和他的船员们浪费了很多时间,在他们的船上装满了黄铁矿(傻瓜的黄金)。食物供应不足,虽然美国原住民带来了一些食物,但史密斯写道,"我们有一半以上的人死了"。
1608年4月,一艘船带来了物资和50名新定居者,史密斯让他们建造住房并种植庄稼。
1608年夏天,史密斯离开詹姆斯敦,去探索切萨皮克湾地区,寻找急需的食物。他绘制的地图对弗吉尼亚州的探险家来说,一个多世纪以来都具有重要价值。在他不在的时候,史密斯让他的朋友马修-斯克里文纳代替他担任总督。斯克里文纳后来在一次前往霍格岛的航行中不幸淹死在风暴中。1608年9月,史密斯被选为当地议会主席,并制定了严格的规则。
1608年10月,一艘载有70名新定居者的船抵达,包括第一批妇女。一些德国和波兰的工匠也来到这里,但他们没有带来任何食品供应。此后,史密斯试图从美洲原住民那里获得食物,而他们需要通过军事力量的威胁才能服从。波瓦坦被大量进入该地区的白人吓坏了,并试图让他们挨饿。
史密斯发现,在定居者和美洲原住民中都有一些人不喜欢他的规则,并计划要杀死他。斯密写道,他受到了宝嘉康蒂的警告。他召集了一次会议,并告诉那些不工作的人,"不工作的人就不能吃......"。在那之后,情况有所改善。
在1609年初的三个月里,即2月、3月和4月,詹姆斯敦的一切都很好,建造了许多住宅,清理了数英亩土地,还做了许多其他工作。然后在4月,老鼠和潮湿破坏了他们储存的所有玉米。他们非常需要食物,史密斯派了一大群定居者去捕鱼,其他人则去下游采集贝类。他们回来时没有食物,只愿意接受提供给他们的微薄的口粮。这激怒了史密斯,他命令他们用枪和工具从印第安人那里换取水果,并命令每个人都要工作,否则就得离开安全的堡垒。一些人离开了,去了美洲原住民的村庄,但波瓦坦的人也遵守了史密斯的法律,即谁不工作就不吃饭。这条规定一直有效,直到他们几乎被饿死,他们才回到家里。
在某个时候,一艘意想不到的船来了,船长是塞缪尔-阿戈尔。他带来了食物和酒,史密斯买下了这些食物和酒,并承诺会还钱。阿戈尔还带来了一个消息,即弗吉尼亚公司将向詹姆斯敦运送更多的物资和定居者,同时还有一位新的总督德拉-瓦尔爵士。
在1609年5月前往弗吉尼亚的航行中,弗吉尼亚公司财务主管托马斯-史密斯爵士安排了约500名殖民者,包括妇女和儿童。一支由九艘船组成的舰队起航了。其中一艘在离开港口后不久在风暴中沉没。海上冒险号在百慕大群岛上遇难,船上有海军司令和斯蒂芬-霍普金斯。一年后,1610年5月,他们乘坐自己制作的小船抵达詹姆斯敦。盖茨很快发现,没有足够的食物来支持殖民地的所有人,于是决定放弃詹姆斯敦。当他们的小船离开詹姆斯敦地区时,他们遇到了一艘载有新总督德拉-瓦尔勋爵的船,后者命令他们返回詹姆斯敦。
1609年8月,约翰-史密斯看到300多名新定居者来到这里,感到相当惊讶。伦敦在送来新的定居者时,并没有计划他们将如何或在哪里生活。
约翰-史密斯船长在他的独木舟上因意外的火药爆炸而严重受伤。1609年10月,史密斯乘船前往英国接受治疗。他花了两年半的时间为詹姆斯敦尽心尽力。他再也没有回到弗吉尼亚。历史已经证实了他在詹姆斯敦最早期的巨大贡献。
殖民者将继续死于各种疾病,那年冬天,500人中估计只有150人幸存。尽管如此,弗吉尼亚公司仍继续资助和运送定居者以维持詹姆斯敦。在接下来的五年里,总督盖茨和托马斯-戴尔爵士继续保持严格的纪律,托马斯-史密斯爵士在伦敦试图寻找熟练的工匠和其他定居者送往詹姆斯敦。